The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33 , No. 1

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33, No. 1, pp.34-40
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Mar 2018
Received 30 Dec 2016 Revised 28 Nov 2017 Accepted 23 Feb 2018
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2018.33.1.34

모링가 잎 (Moringa oleifera, Leaf) 에탄올 추출물의 화장품 소재 특성
김인혜 ; 이재화*
신라대학교 의생명과학대학 제약공학과

Cosmetic Effects of Ethanol Extract from the Drumstic-tree, Moringa oleifera Leaf
In Hae Kim ; Jae Hwa Lee*
Department of Pharmaceutical Engineering, College of Medical & Life Science, Silla University, Busan 46958, Korea, Tel: +82-999-5831, Fax: +82-999-5831 (jhalee@silla.ac.kr)
Correspondence to : Department of Pharmaceutical Engineering, College of Medical & Life Science, Silla University, Busan 46958, Korea Tel: +82-999-5831, Fax: +82-999-5831 e-mail: jhalee@silla.ac.kr


© 2017 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
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Abstract

To investigate the cosmetic effects of drumstictree (Moringa oleifera, leaf) extract on skin care, we measured antioxidant and antimicrobial activities, tyrosinase and elastic activity inhibition. B16F10 melanoma cell has been used to measure cell viability. It was 42±2.66 mg/g GAE base and 16.5±1.7 mg/g Naringin base as a measurement result of total polyphenol and total flavonoid contents. DPPH free radical scavenging activity was 89% in a concentration at 500 μg/ mL. Drumstic-tree (Moringa oleifera, leaf) extract exhibited in vitro antimicrobial activity against MRSA CCARM3115. EtOH extract of Moringa oleifera showed 25.1% (L-Tyrosine) and 20.1% (L-DOPA) of tyrosinase inhibition, respectively. In elastase inhibition assay, EtOH extract of Moringa oleifera showed 29.6% of inhibition. At a concentration of 200 μg/mL, tyrosinase and elastase activation were found to inhibited dose-dependent. These results suggest EtOH extract from Moringa oleifera has excellent activities in the antiwrinkle and whitening. Therefore, it expected to be used effectively for development of functional cosmetic materials.


Keywords: drumstic-tree, Moringa oleifera, methicillin resistance Staphylococcus aureus, anti-wrinkle, whitening

1. INTRODUCTION

최근 소득수준의 향상 및 산업의 발달로 인해 새로운 생활코드로 외형적 모습보다는 심신의 안정을 통해 삶의 만족도를 높이려는 웰빙트랜드 (Well-being trend), 웰빙 라이프스타일(Well-being life style)이 나타나고 있다. “Well-being” 개념은 통합적 건강을 중심에 두고, 건강한 몸과 여유 있는 마음을 강조하고 육체와 정신의 조화를 통해 행복하고 안락한 삶을 지향하는 삶의 형태 혹은 문화현상을 의미한다. 또한 개인과 가족의 건강한 삶을 의미하는 웰빙에 환경의 개념을 더한 로하스 (LOHAS: Lifestyle of Health & Sustainability)가 미래소비의 트렌드가 될 것이며, 삶의 구체적인 방법으로 전체산업 및 의식주 전반에 영향을 미치며 앞으로도 빠르게 확산될 것으로 전망한다 [1]. 이러한 욕구가 건강과 자연에 중점을 두고 자연계 혹은 천연에 존재하는 다양한 동식물로부터 얻어지는 각종 유용한 성분들과 높은 기능성을 갖는 소재 개발이 가능하며 식품 산업, 제약 산업, 화장품 산업 등 산업체 전반에 자연소재로 거대한 주류를 형성하고 있다. 더불어 환경오염 문제로 인한 각종 유해물질에 대한 사회적 관심이 고조되면서 환경친화적이며 위생적이고 웰빙 감성과 부합하는 화장품 산업의 필요성이 요구되었다 [2].

국내에서 자연주의 화장품은 자연주의 표방 화장품의 개념으로 천연 화장품, 내추럴 화장품, 자연주의 화장품, 한방 화장품 및 유기농 화장품 등을 포괄한다. 최근 자연주의 화장품의 개발 동향으로는 한 개의 제품내의 의약품, 의약외품, 의료기기, 화장품, 식품 등의 요소가 혼재되어 있어, 기존의 기준으로는 어느 하나의 분류에도 명확하게 해당하지 않는 복합제품들이 늘고 있다. 세계적으로 널리 쓰이는 화장품의 최신성분은 약리적 활성 성분을 포함하여 매우 다양한 것으로 나타나는데 예로부터 알려졌던 천연물로부터 원료가 새로운 방법에 의해 추출되어 주목을 받은 것도 많고, 천연 또는 합성의 고분자 화합물의 종류와 약리적 기능을 나타내는 성분이 많은 까닭에 현대 화장품산업에서의 제품의 특징은 화장품과 의약품 사이의 구분이 좁아지고 있는 특징이 있다. 이러한 경향에 비추어, 본 연구에서는 약리적 기능만 알려져 있는 모링가 (Moringa oleifera)를 이용하여 약리 효과 및 화장품 소재로서의 가능성을 알아보고자 하였다.

모링가 (Moringa oleifera)는 moringaceae의 한 종류로 Drumstic-tree로 불리며 열대지역에 널리 분포하며 아시아, 아프리카, 아라비아 등에서 재배되고, 단백질과 비타민, 칼슘 등이 풍부해 영양가가 높고 다양한 생리활성을 지니는 관상용 또는 식의약용 나무로 알려져 있다 [3]. 모링가의 잎은 β-카로틴, 단백질, Vit. E, 칼슘 등이 풍부하게 함유되어 있으며, 모링가의 씨앗 추출물은 Flavonoid, Isothiocyanates, Glucosinolates, Thiocarbonates 등의 Phytochemical이 함유되어 있어 많은 생리활성을 보고하고 있다 [4]. 이러한 영양학적 약리학적 특성 때문에 모링가는 콜레스테롤 제거 및 간기능 보호 [5], 종양세포의 apoptosis와 anti-proliferation 효과 [6]. 관절염 치료 [7], 신경세포보호 효과 및 암세포의 전이 저해 효과 [8], 피부 염증 [9]과 상처 치유에 효과가 있는 것으로 알려져 있다 [10,11].

본 연구에선 천연물로부터 화장품 소재를 탐색하던 중, 생리활성이 우수하다고 알려진 모링가 (Moringa Oleifera, leaf) 잎을 이용하여 미백, 주름 개선, 항산화 및 항균 활성 등 일련의 연구를 진행하였다.


2. MATERIALS AND METHOD
2.1 실험재료 및 시약

본 연구에 사용된 모링가 (Moringa Oleifera, leaf)는 필리핀 (Repiblic of the Philippines)에서 수입하여 사용하였고, 건조된 드럼스틱 잎 (1 kg)의 10배 (w/v%)에 해당하는 EtOH을 가하여 24 h 정치한 후 원심분리 (3.000 rpm × 20 min)와 농축 단계를 진행하였다. 이 과정을 총 3회 반복 추출하였다. 추출액을 여과 (Whatman No. 2, Whatman, Piscataway, New jersy, USA)한 후 동결건조한 후 본 실험에 사용하였다.

사용된 기기 및 시약으로는 UV-visible Spectrophotometer는 Mecasys (Korea), ELISA Multiscan Reader는 Thermo scientific (Finland), Fluorescence Spectrophotometer는 Infinite F200 Pro (TECAN/Austeria) 제품을 사용하였다. Millex-LCR13 (0.5 μm), Ultra free-MC (0.45 μm)와 Syringe filter (0.45 μm)는 Water사 (Miliford, MA, USA)에서 구입하였고 사용된 배지로는 Tryptic Soy Broth (TSB)와 Lactose-Boullin (LB), Muller-Hinton Broth (MHB)는 Merk사 (Darmstadt, Germany)에서 L-Ascorbic acid, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 및 Folin-Ciocalteu phenol Reagent는 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다. HPLC-grade의 EtOH, H2O는 TEDIA (Ohio, USA)에서 구입하였고, 그 외에 모든 특급 시약을 사용하였다.

2.2. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

총 폴리페놀 함량은, 시료 100 μL에 2% Sodium carbonate (Na2CO3) 2.0 mL을 혼합 후, 실온에서 3 min 반응 후, 1.0 N Folin-Ciocalteu phenol Reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 2.0 mL을 첨가하여 25oC에서 30 min 반응하였다. ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 Gallic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 표준시약으로 이용하여 정량하였고 이 방법은 AOAC의 Folin-Denis법을 일부 변형하여 사용하였다 [12]. 또한, 총 플라보노이드 함량은 농도를 50 mg/mL로 녹인 각각의 시료 100 μL에 Diethylene glycol 1.0 mL을 가한 후, 1.0 N NaOH 100 μL를 첨가하여 37oC에서 1 h 반응한 후, ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland)를 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 Naringin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. USA)을 표준시약으로 이용하여 정량하였고 분석법은 Davis 법을 일부 변형한 방법을 사용하였다 [13].

2.3. DPPH 라디컬 소거능

항산화 측정은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 방법으로 free radical scavenging activity를 측정하였다. EtOH에 용해한 0.2 mM DPPH 용액 60 μL와 농도별로 조제한 시료용액 20 μL를 96 well plate에 넣어 실온에서 15 min 반응시킨 후, ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland)를 이용하여 517 nm에서 측정하였다. Radical scavenging activity (RSA, %)는 시료 첨가군과 무 첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었고, 표준시료로는 L-Ascorbic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다 [14].

Radical Scavenging Activity RSA, %=Ab-As/Ab×100(1) 
Ab: Blank absorbance
As: Sample absorbance

2.4. 항균활성

모링가 추출물 (Moringa oleifera extract, MOE)의 항균활성을 측정하기 위하여 Disc method를 사용하여 분석하였다 [15]. 먼저 Bacillus subtilis PM125을 37oC로 TSB에서 mid-logarithmic phase까지 배양하였다 (OD570 = 0.1, 5 × 107 CFU/mL). 각각의 시료를 Paper disc에 흡수시켜 건조하였다. 배양한 균액 100 μL를 TSA 배지에 도말한 후, 37oC, 18 h 배양 후, clear zone의 크기로 활성을 측정하였다. 본 연구에 사용한 균주는 Gram-positive bacteria로는 Bacillus subtilis PM125, Micrococcus luteus KCTC1056 및 Staphylococcus aureus KCTC1946을 항생제내성균주로는 Methicillin Resistance Staphylococcus aureus (MRSA) CCARM3561, CCARM3115 및 CCARM3089 등의 균주는 항생제내성균주은행 (Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes, CCARM)에서 분양 받아 본 연구에 사용하였다. Gram-negative bacteria로는 Escherichia coli D31, Escherichia coli KCTC1184, Enterobacter aerogense KCTC2190, Klebsiella pneumonia KCTC2208, Pseudomonas areoginosa KCTC2004, Salmonella typhimurium KCTC1925, 그리고 어병 세균으로는 Vibrio parahaemolyticus KCTC2471를 사용하였다. 이 균주들은 한국미생물자원센터 (Korean Collection for Type Culture, KCTC)에서 분양받아 본 연구에 사용하였다.

2.5. Tyrosinase 저해 활성

Tyrosinase 활성 기질은 L-Tyrosine과 L-DOPA에 대한 tyrosinase inhibition assay로 다음과 같이 측정하였다. 사용된 buffer로는 0.1 M Potassium phosphate buffer (pH 6.8) 200 μL에 농도별로 희석된 시료 20 μL, Mushroom tyrosinase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 20 μL (1,000~1,500 U/mL)에 기질 1.5 mM L-Tyrosine 20 μL 혹은 1.5 mM L-DOPA를 혼합하여 37oC 15 min 반응시킨 후, ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. Tyrosinase inhibition ratio는 식 (2)로부터 계산하였으며, 이 때 대조군은 시료 대신 Potassium phosphate buffer를 넣은 것으로 정의하였고, 효소를 넣지 않은 공시험의 흡광도를 뺀 값을 tyrosinase 활성 저해 효과에 이용하였다. 표준물질로는 Arbutin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하였다 [16].

Tyrosinase inhibition ratio %=1-OD of sample/Od of control×100(2) 
2.6. Elastase 저해 활성

Elastase 저해 활성 측정을 위한 elastase는 Porcine pancreatic elastase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. USA)를 사용하였고 방법은 다음과 같다. 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.6)를 넣어 반응조건을 만든 다음, 농도별 모링가 추출물 100 μL, Porcine pancreatic elastase 20 μL (2,500 U/mL)에 특이적인 기질인 8.8 mM STANA (N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 20 μL를 혼합하여 25oC 15 min 반응시킨 후, ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland)을 이용하여 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 대조군은 시료 대신 Tris-HCl을 넣은 것으로 정의하였고, 효소를 넣지 않은 공시험의 흡광도를 뺀 값을 Elastase 활성 저해 효과에 이용하였다. Elastase inhibition ratio는 식 (3)로부터 계산되었다. 표준물질은 Ursolic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다 [17].

Elastase inhibition ratio %=1-OD of sample/Od of control×100(3) 
2.7. 세포독성 측정

실험에 사용한 B16F10 mouse melanoma cell line은 한국 세포주 은행에서 분양 받아 100 U/mL Penicillin-streptomycin과 10% Fetal Bovine Serum (Gibco Co., USA)이 함유된 DMEM 배지를 사용하였으며 배양된 B16F10 mouse melanoma cell line을 96 well plate에 1 × 104 cells/well의 농도로 분주하여 24 h 배양하여 부착 및 안정화한 후, 농도별로 희석한 시료를 처리하여 다시 24 h 배양하였다. 배양 후 각 well에 10 μL의 CCK-8 용액 (Enzo Life Science, New york, USA)을 첨가했다. 2 h 동안 CO2 배양기 안에서 반응을 시킨 뒤, microplate reader를 사용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정했다. 시료 대신 PBS를 사용한 Blank의 흡광도를 기준으로 세포 생존율을 산출하였다 [18].

2.8. 통계처리

각 실험군 간의 비교분석은 3회 반복 실험에 의한 평균값으로 나타내었고, 대조군과 실험군의 통계학적 유의성 검정은 Student's t-test를 사용하였으며 표준편차 (p-value < 0.05) 수준에서 유의성을 검정하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

모링가 추출물 (MOE)에 함유된 총 폴리페놀 화합물과 플라보노이드 함량을 측정한 결과를 나타내었다 (Table 1). MOE의 총 폴리페놀 함량은 42±2.66 mg/g GAE base, 즉 Gallic acid로 환산하여 나타내었고, 플라보노이드 함량도 16.5±1.7 mg/g Naringin으로 나타났었다. 이 분석법은 폴리페놀 화합물이 Phosphomolybdate와 반응하여 청색을 나타내는 현상을 Folin-Denis 법을 변형하여 나타내었다. 식물체 추출물의 생리활성을 나타내는 화합물로 보고된 사례를 보면, 페놀화합물 혹은 플라보노이드 물질에 기인하여 항산화 활성 또는 생리 활성이 나타나는 것으로 보고되어 있다 [19]. 이러한 활성은 폴리페놀류의 화합물이 대개 hydroxy group를 갖고 있으며, 이 functional group이 활성산소나 hydroxy radical에 대해 소거작용을 하는 것으로 알려져 있다 [20]. 이에 높은 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량으로 인해 항산화 활성 및 항균 활성을 기대할 수 있을 것으로 생각된다.

Table 1. 
Total polyphenol and total flavonoid contents of drumstic-tree leaf extract from the Moringa oleifera
Sample Total polyphenol content (Gallic acid mg/g*) Total flavonoid content (Naringin mg/g*)
MOE 42 ± 2.66 mg/g GAE base 16.5 ± 1.7 mg/g Naringin
*mg/g, base on dry weight. Each value is expressed a means ± SD of triplicate determinations. *p<0.05.

3.2. 항산화 활성 및 항균 활성

모링가 추출물 (MOE)의 항산화 활성은 DPPH radical이 안정한 free radical로 다른 원자나 분자로부터 전자 혹은 양성자를 받아들여 안정한 분자로 변하는 성질을 이용하여 자체의 정색성을 소실하는 DPPH의 특성을 이용하여 분석하였다 [21]. DPPH에 대한 radical 소거능을 농도별로 분석하였으며, 대조군은 L-Ascorbic acid로 비교하였다 (Fig. 1). Fig. 1을 보면 농도 의존적으로 농도가 증가함에 따라 활성이 증가하는 양상을 보였고, 대조군인 항산화제로 널리 알려진 L-Ascorbic acid 보다는 활성이 낮은 것으로 판명되었다. 그 결과를 보면, MOE는 500 μg/mL의 농도에서 54.8%의 가장 높은 소거능력을 나타내었고 250 μg/mL의 농도에서는 47.2% 활성을 나타내었다. 식물 추출물의 DPPH radical 소거에 의한 전자공여 능력 (electron donating ability)이 페놀화합물과 플라보노이드 물질에 의한 항산화 활성을 나타내는 것으로 볼 때 MOE의 구성성분인 페놀화합물과 플라보노이드 등의 항산화 물질에 의한 상호작용으로 나타나는 것으로 간주한다.


Fig. 1. 
DPPH radical scavenging activity of drumstic-tree leaf extract from the Moringa oleifera. L-Ascorbic acid was used as a positive control. Each value is expressed as a means±D of triplicate determinations. p-value: Students's t-test. p<0.05 compared with control.

MOE의 항균 활성은 DISC method 법에 의한 clear zone 직경으로 나타내었다. Positive control로는 Ampicillin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하여, 각 균주에 대한 clear zone의 크기를 비교하였다. MOE 추출물의 농도는 1,000 μg/mL이며 대조군인 Ampicillin의 농도는 500 μg/mL로 진행하였다. 활성을 나타낸 균주를 대상으로 Fig. 2에 먼저 Grampositive bacteria인 B. subtilis PM125에 대한 활성은 Ampicilline이 40 mm, MOE는 8 mm의 활성을 나타내었다 (Fig. 1(d)). 또한, MOE의 큰 특징은 항생제 내성균주인 MRSA에 대한 활성이 크게 보여주었고, Fig. 2(b)를 보면 MRSA CCARM 3115에 대한 활성이 Ampicillin의 36 mm에 비해 26 mm로 가장 큰 활성은 나타내었지만, 반면에 Staphylococcus aureus에 대한 활성을 나타내지 않았다. 특히 Gram-negative bacteria에 대한 활성을 나타내지 않았다 (Data not shown). 다만, 항생제 내성 균주인 MRSA CCARM3115에 대한 결과만 괄목할 만한 활성을 보여주었다. 이러한 결과, MRSA CCARM3115의 생체막과 특이적으로 반응하는 활성 메커니즘이 작용하지 않을까 추정할 수 있으며, 이후의 연구에서 항균 활성 메커니즘을 규명하는 실험을 진행할 수 있는 계기를 마련한 것으로 생각된다. 기존에 알려진 Drumstic-tree의 항암 활성, 면역학적 활성 및 약리학적 활성과 비교하여 활성 메커니즘을 규명하는데 좋은 Data을 제공하는 계기를 마련하는 것으로 생각된다. 또한, 적혈구 막에 대한 활성을 보기 위해 Human erythrocyte (RBC)에 대한 용혈 활성을 측정한 결과, 1,000 μg/mL의 농도에서 2% 미만의 활성을 나타내었고 RBC에 대한 손상을 주지 않은 것으로 판명되었다 (Data not shown).


Fig. 2. 
Anti-microbial activities of drumstic-tree leaf extract from the Moringa oleifera. A 50 μL aliquots of each extract was applied to filter paper and the paper lown placed on a MRSA CCARM3089 (a), MRSA CCARM3115 (b), MRSA CCARM3561 (c) and B. subtilis PM125 (d). A; Ampicillin concentration was 500 μg/mL. B; MOE concentration was 1,000 μg/mL.

3.3. Elastase 저해 활성

피부 진피층에 있는 Matrix metalloproteinases (MMP's)는 활성산소 및 자외선 등에 의한 세포의 매트릭스 파괴로 인한 주름 생성과 노화의 주 원인으로 알려져 있다 [22,23]. MMP's를 이루는 주요성분으로는 Collagenase, Gelatinase 및 Elastase 등이 있으며, 그 중 Elastase는 진피 내 피부 탄력을 유지하는 기질 단백질인 Elastin, Fibrotectin을 포함한 다양한 단백질을 분해하며, Collagen을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이며, 피부의 주름 및 탄력성 소실 등을 유발한다고 보고되어 있다 [24]. Elastase 저해 활성 측정은 피부 주름 개선 효과의 평가로 널리 이용하고 있는 방법이다. 이 측정방법은 기질인 N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide가 elastase에 의해 분해되어 생성되는 물질인 p-nitro-aniline (PNA) 양을 흡광도을 이용하여 측정함으로써 Elastase 활성 억제를 평가하였다.

MOE의 Elastase 저해 활성은 Fig. 3에 나타내었다. 먼저 positive control은 Urosolic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 농도는 50 μg/mL이며 56.5%의 저해능을 나타내었고, MOE는 200 μg/mL의 농도에서 29.6%. 100 μg/mL의 농도에서는 19.6%의 활성을 나타내었으며 시료의 농도와 비례하여 농도 의존적으로 저해 활성을 확인할 수 있었다. 또한 12.5 μg/mL의 농도에서는 1.25%라는 미미한 활성을 나타내었다.


Fig. 3. 
Elastase activity of drumstic-tree leaf extract from the Moringa oleifera. Urosolic acid was used as a positive control. Urosolic acid concentration was 50 μg/mL. Each value is expressed as a means±D of triplicate determinations. p-value: Students's t-test. p<0.05 compared with control.

3.4. Tyrosinase 저해 활성

기능성 화장품은 미백 제품, 주름 개선 제품 및 자외선 보호제품으로 분류할 수 있고, 미백 제품은 주로 멜라닌 합성 억제, Tyrosinase 저해, 피부 각질 제거 및 피부 색소 침착 방지 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다 [25]. 피부는 자외선에 노출되면 Melanin 세포 내의 Tyrosine이 Tyrosinase의 생합성 작용으로 산화 반응 때문에 Melanin을 생성하며 이 생성된 Melanin은 피부를 보호하는 기능도 있지만 과잉생산된 Melanin이 피부에 기미, 주근깨 등 과색소침착을 일으킨다. Melanin 생성 효소인 tyrosinase 효소 자체를 억제하면 미백 효과를 기대할 수 있다.

Tyrosinase는 Cu2+와 결합하는 효소로 동물, 식물, 미생물 및 사람 등에 널리 분포된 Polyphenol oxidase로 Melanin 합성과정에서 속도를 제한하는 등 Melanin 합성의 주요한 조절적 단계를 조절하는 중요한 역할을 하고 있다 [26]. 이러한 Melanin 중합체 생합성을 효과적으로 저해하기 위해 Tyrosinase 저해 활성을 측정하는데, Tyrosinase 저해 활성은 기질로 L-Tyrosine과 L-dihydroxyl-phenylalanin (DOPA)를 둘 다 사용하여 측정하였다. 시료의 농도가 200 μg/m, 100 μg/mL, 50 μg/mL, 25 μg/mL 및 12.5 μg/mL으로 진행하였으며, L-Tyrosine이 경우, 각각 25.1%, 21.6%, 18.7%, 16.8%, 8.6% 및 8.5%의 Tyrosinase 저해 활성을 나타내었고, L-DOPA인 경우도 각각, 20.5%, 17.8%, 14.6%, 12.8%, 12.6%, 10.6%의 결과치를 보여주었다. 그 결과는 농도 의존적으로 Tyrosinase 저해 활성을 나타내었다. 표준시료인 Arbutin의 경우 200 μg/mL의 농도에서 35.7% Tyrosinase 저해 활성을 나타내었다 (Fig. 4). MOE의 경우 표준물질인 Arbutin보다는 활성이 낮았지만 주름개선과 미백소재로서의 활용가능성이 있으며 미백과 Antiaging의 소재로써의 잠재능을 확인 할 수 있었다.


Fig. 4. 
Tyrosinase activity of drumstic-tree leaf extract from the Moringa oleifera. Arbutin was used as a positive control. Each value is expressed as a means±D of triplicate determinations. p-value: Students's t-test. p<0.05 compared with control.

3.5. 세포독성 시험

생체 내에서 Melanogenesis는 Tyrosine을 기질로 하여 Tyrosinase에 의해 Hydroxylation 반응을 거쳐 3,4-dihydroxylindolephenylalamine (L-DOPA)으로 되고 이것은 다시 L-DOPA quinone으로 산화된다. 이후 아미노산 혹은 단백질과 중합 반응에 의해 Melanin으로 합성된다 [27,28]. MOE에 의한 B16F 10 mouse melanoma cell에서의 세포독성을 알아보기 위해 CCK-8 assay kit을 이용하여 분석하였다. MOE를 처리하지 않은 세포, 즉 시료 대신 PBS를 처리한 세포를 100%로 대조군으로 정의하여 시료군과 비교하였다. 모링가 EtOH 추출물에 대한 B16F10 mouse melanoma cell에 대한 세포의 생존율을 확인한 결과, Fig. 5와 같이 대조군과 비교해 200 μg/mL의 이하의 농도에서는 90% 이상의 생존율을 나타내었으며, 고농도인 500 μg/mL에서 82.6%의 생존율을 확인할 수 있었다 (Fig. 5). 이러한 결과는 MOE가 B16F10 mouse melanoma cell에 대한 독성을 거의 유발하지 않으며, MOE의 적정 농도에 대한 기초 자료와 함께 화장품 미백 소재로서의 안정성을 확인할 수 있었다.


Fig. 5. 
Effect of drumstic-tree leaf extract from the Moringa oleifera on cell cytotoxicity in B16F10 mouse melanoma cell. Cells viability was determined by CCK-8 cell counting kit. The viability of untreated control cells was defined as 100%. Each value is expressed as a means±D of triplicate determinations. p-value: Students's t-test. p<0.05 compared with control.


4. CONCLUSION

모링가 잎 (Moringa oleifera, leaf)의 EtOH 추출물의 기능성 화장품 소재로 활용하기 위한 항산화, 항균, 미백 및 주름 개선 효과를 검증하였다. MOE의 총 폴리페놀 함량은 42±2.66 mg/g GAE base이며, 플라보노이드 함량도 16.5±1.7 mg/g Naringin으로 나타났었다. 항산화 효과인 DPPH radical 소거능은 500 μg/mL의 농도에서 54.8%이며, 항균 활성은 항생제 내성균주인 MRSA CCARM3115에 대하여 26 mm의 clear zone을 확인할 수 있었다. 주름 개선 효과인 elastase 저해 활성은 200 μg/mL에서 29.6% 저해능을 보여주었다. Tyrosinase 저해활성은 200 μg/mL의 농도에서 L-Tyrosine을 기질로 하였을 때가 25.1%, L-DOPA를 기질로 사용하였을 때 20.5%로 melanin 합성 또는 저해하는 것을 짐작할 수 있었다. 또한, B16F 10 mouse melanoma cell을 이용하여 세포독성을 조사한 결과, 200 μg/mL 이하의 농도에서 90% 이상의 세포 생존율을 보여 안정성이 높은 소재임을 확인하였다. 따라서 본 실험 결과 모링가 잎 (Moringa oleifera, leaf) EtOH 추출물은 화장품 산업에서 천연물 유래의 기능성 소재로써 잠재적인 가능성과 산업적 이용가치를 지니고 있는 것으로 생각된다.


Acknowledgments

본 연구는 2015년도 부산광역시의 재원으로 지원을 받아 수행된 Brain Busan 21 (BB21, 과제번호 2016-04-002) 사업의 연구비로 진행된 결과의 일부이며 이에 감사드립니다.


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