The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 36 , No. 2

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 36, No. 2, pp.165-170
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Jun 2021
Received 10 Apr 2021 Accepted 24 May 2021
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2021.36.2.165

항시발현 프로모터를 이용한 대장균에서의 β-glucosidase 가용성 발현증진
정대은 ; 유수경 ; 최혜지 ; 김근중*
전남대학교 자연과학대학 생물학과

Enhancing the Soluble Expression of a β-Glucosidase in Escherichia coli by Using a Constitutive Promoter
Dae-Eun Cheong ; Su-Kyoung Yoo ; Hye-Ji Choi ; Geun-Joong Kim*
Department of Biological Sciences, Chonnam National University, Gwangju 61186, Korea
Correspondence to : Department of Biological Sciences, Chonnam National University, Gwangju 61186, Korea Tel: +82-62-530-3403, Fax: +82-62-530-3409 E-mail: gjkim@chonnam.ac.kr


© 2021 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
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Abstract

Sinorhizobium meliloti β-glucosidase (β-D-glucoside glucohydrolase: EC 3.2.1.21) is an exocellulase and cleavages β-(1-4) glycosidic bonds in poly- and oligosaccharides. It has also high activity toward indican, a precursor to indigo and indirubin used as clothing dyes, cosmetics and antimicrobial agents. Typically, this enzyme induced with IPTG under the control of the corresponding promoter was mainly produced as non-functional aggregates in Escherichia coli XL1-Blue and BL21 (DE3). In this study, expression vectors with a mined constitutive promoter (CEM) from metagenome were employed to increase the soluble expression of S. meliloti β-glucosidase. The resulting efficiency of constitutive expression systems was compared with those of the commonly used inducible systems in terms of the specific activity and solubility ratio. Consequently, recombinant β-glucosidases were mainly expressed in soluble form (82-97%) by the constitutive promoter CEM and thus showed the highest specific activity in the recombinant E. coli XL1-Blue harboring pCEMT.


Keywords: β-glucosidase, constitutive promoter, recombinant protein, soluble expression

1. INTRODUCTION

전통적인 염료로 꾸준히 이용되는 인디고와 그의 유도체는 식품, 의약 그리고 화장품 첨가제로도 이용되는 가치있는 기능성 물질이다 [1,2]. 그 중 가장 큰 시장을 형성하고 있는 합성인디고는 Polygonum tinctorium에서 생산되는 전통적인 천연인디고에 비해 저비용으로 대량생산이 수월하다는 장점을 지니고 있다. 하지만 기능성 첨가제로서 염료나 식품, 화장품 그리고 의약품 성분으로 이용될 때, 합성인디고는 피부에 부작용 (allergy)을 유발하기도 하며, 경우에 따라서는 암과 같은 중증질환의 발병과도 관련이 있을 것이라는 보고도 있다 [3,4]. 이에 반해 전통적인 발효법으로 생산되는 천연인디고는 독성이 없으며 친환경적이나, 식물(쪽이나 대청)의 수확시기나 성장상태에 따른 표준화와 규격화가 용이하지 않아 산업적 품질관리 (QC)가 매우 어렵다는 단점을 지니고 있다 [5]. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 트립토판이나 골격이 유사한 방향족 화합물을 이용하여 인디고를 생산하는 생물전환법이 개발되었다 [6,7]. 다양한 공정개발이나 반응최적화를 통해 리터당 g 이상의 의미있는 생산성이 보고되고 있음에도 불구하고, 비균일한 생산성이나 부산물의 생성, 그리고 전구체로 이용되는 기질에 포함된 방향족화합물(naphthalene 과 toluene)에 의한 독성유발 등은 해결해야 할 난제로 남아 있다 [8,9]. 또 다른 생물전환 방법으로는 Novozyme 188과 같은 β-glucosidase을 이용해 쪽이나 대청식물에 존재하는 인디칸 (indican)을 전구체로 인디고를 생산하는 방법이 있다 [10]. 이러한 효소는 현재 생산이 중단된 상태이나 유사한 활성을 지닌 대체효소가 존재하는 것으로 알려져 있다.

본 연구자들도 인디칸을 이용한 인디고 생물전환에 이용 가능한 β-glucosidase (β-D-glucoside glucohydrolase: EC 3.2.1.21)를 Sinorhizobium meliloti 로부터 발굴해 P. tinctorium 유래의 인디칸으로 인디고를 생산하는 공정을 보고한 바 있다 [11]. 이러한 활성을 지닌 단백질을 암호화한 유전자는 다양한 균주에서 쉽게 발견되나, 대부분의 단백질은 불용성 응집체 (inclusion body)로 발현되며, 벡터나 숙주의 교체, 유도발현 조건의 변화에서도 발현특성이 개선되지 않았다 [11]. MBP를 융합한 경우에는 가용성 발현비율이 증가하나, 재현성이 낮아 활성편차가 크며 고가의 유도체 (IPTG)를 필요로 하는 문제점 등은 여전히 해결해야할 과제이다 [11-13]. 이러한 발현품질의 문제는 전술한 융합파트너의 채용이나 샤페론 (chaperone)의 동시발현, 방향적 인공진화에 의한 단백질 개량, 적응진화를 이용한 숙주의 선별 등을 통해 개선할 수 있다. 경우에 따라서는 항시발현 프로모터의 채용을 통해서도 가용성의 유도가 가능한 것으로 알려져 있다 [14].

본 연구에서는 앞서 보고한 메타지놈 유래의 항시발현 프로모터를 채용한 발현시스템 [15]을 이용하여 전형적인 유도발현 시스템으로는 불용성 응집체로 주로 발현되는 S. meliloti 유래의 β-glucosidase의 가용성 발현 증진을 시도하였다. 결과적으로, 새로이 구축된 항시발현시스템을 통해 기존에 흔히 이용되던 유도발현 시스템보다는 크게 증가한 가용성 발현비를 달성하였고, 높은 비활성 (specific activity)을 지닌 재조합 대장균을 확보할 수 있었다.


2. MATERIALS AND METHODS
2.1. 균주와 발현벡터

E. coli XL1-Blue와 BL21(DE3)을 재조합 벡터의 제작과 단백질 발현을 위한 숙주로 이용하였다. 실험에 사용한 pCEMT와 pRCEMT 항시발현 벡터는 선행연구에서 제작된 것을 이용하였고 (Fig. 1), 유도발현 벡터 pTrc99a와 pET-21d(+)는 Pharmacia Biotech와 Novagen에서 구매해 이용하였다. 엄격 조절 (tight regulation)되는 araB 프로모터를 기반으로 단백질 접힘을 도와주는 샤페론인 GroES/GroEL, 그리고 DnaK/DnaJ/GrpE가 동시발현되는 발현벡터 pGro7과 pKJE7은 Takara에서 구입하였다. 항시발현 프로모터를 장착한 발현 벡터 pCEMT와 pRCEMT에 클로닝할 β-glucosidase 유전자는, pMAL-c2X-β-glucosidase [13]를 주형으로 PCR로 증폭해 이용하였다. 본 연구에서 불용성 응집체를 형성하는 β-glucosidase의 가용성 발현유도에 사용한 항시발현 벡터 pCEMT와 pRCEMT의 제작과정과 이에 따른 유전적 구성요소 (genetic organization)는 참고문헌에 자세히 기술되어 있다 [15].


Fig. 1. 
Schematic representation of constitutive expression vector maps used for soluble expression of a β-glucosidase. (A) pBluescript II SK-based pCEMT. (B) pTrc99A-based pRCEMT.

2.2. 유전자의 클로닝과 재조합 균주 배양

항시발현 벡터 pCEMT와 pRCEMT에 클로닝할 β-glucosidase 유전자는 pMAL-c2X-β-glucosidase 재조합벡터를 주형으로, 두 개의 프라이머 GluF (5’-ATCCATGGTGATCGAAGCCAAGA-3’; 밑줄은 제한효소 NcoI 인식서열)와 GluR (5’-ATAAGCTTTCTCCCGGCTTG-3’; 밑줄은 제한효소 HindIII 인식서열)을 이용하여 PCR 로 증폭하였다. 증폭된 유전자는 제한효소를 처리하여 같은 제한효소로 절단된 pCEMT와 pRCEMT 벡터에 접합시켜 도입하였다. 이를 전형적인 열충격법으로 형질전환하여 재조합 균주를 제작하였다. 대조군으로 이용한 유도발현 (inducible expression) 시스템 제작을 위하여, 동일한 β-glucosidase 유전자를 pTrc99a와 pET21d(+) 유도발현 벡터에 같은 방법으로 클로닝하였다. 또 다른 대조군인 녹색 형광 리포터 단백질 GFPuv가 도입된 pCEMT와 pRCEMT 재조합벡터는 선행연구에서 제작한 클론을 이용하였다 [15]. 선별된 단일 클론의 경우, Luria-Betani (LB) 고체배지에 계대배양하며 실험에 이용하였다. 단백질 생산을 위한 배양은 동일한 조성을 지닌 액체배지에서 수행하였다. 모든 배양은 37oC, 240 rpm 조건에서 선택마커에 따른 항생제 (100 μg ampicillin/ml 이나 34 μg chloramphenicol/ml)를 첨가해 수행하였다.

2.3. 단백질 발현과 분석

β-Glucosidase가 클로닝된 재조합 벡터를 지닌 E. coli 클론은 액체 LB 배지에 접종하여 전술한 조건으로 전배양을 실시하였다. 전배양된 세포는 10분의 1로 희석하여 동일한 배지에서 같은 조건으로 본 배양을 실시하였다. 배양시간에 따라 일정양의 시료를 채취해 OD를 측정 (UV-1700, Shimadzu)해 생장정도를 분석하였고, SDS-PAGE (10%)로 단백질 발현양상을 분석하였다. 이때 대조군으로 이용한 전형적인 유도발현 시스템을 지닌 재조합벡터 (β-glucosidase 유전자가 클로닝된 pTrc99a와 pET21d(+)와 경우에 따라 단백질접힘을 돕는 샤페론 발현 벡터 pGro7과 pKJE7을 동시발현시킨 경우)를 지닌 클론의 배양조건은 다음과 같다. 유도발현 벡터의 유전자발현 유도는 본 배양 세포의 농도가 OD600 기준으로 0.5에 도달하였을 때, IPTG 0.2 mM, 혹은 IPTG와 arabinose를 각각 0.2 mM과 0.2% 첨가한 후, 90 분간 더 배양하는 방법으로 수행하였다. 배양된 세포는 OD600 기준으로 2.0이 되게 조정하여 5,000×g, 4oC에서 10 분간 원심분리해 수확하였다. 회수된 세포는 삼차 증류수로 2회 이상 세척한 후, OD600 값이 10이 되게 세포파쇄 용액 (100 mM sodium phosphate, pH 7.0)을 첨가하였다. 준비된 시료는 전형적인 초음파법 (Sonics & Materials, U.S.A)으로 4oC에서 세포를 파쇄한 후, 불용성분획과 상등액을 회수하기 위해 16,100×g, 4oC 조건으로 30 분간 원심분리하였다. 발현된 전체 단백질 양과 불용성, 그리고 가용성 분획의 단백질 발현 비율은 10% SDS-PAGE를 수행해 분석하였다. 이를 위해 SDS-PAGE 겔의 단백질 밴드는 Coomassie blue 시약으로 염색하였으며, densitometer (GS800, Bio-Rad)를 이용하여 정량하였다. 신뢰성 있는 결과값을 얻기 위하여 모든 실험은 같은 조건으로 3회를 수행해 평균값을 기재하였다.

2.4. β-Glucosidase 활성측정

β-Glucosidase의 활성은 전형적인 p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG)를 기질로 이용해 측정하였다. 활성측정을 위한 효소는 가용성 분획인 상등액 (supernatant)을 정량해 이용하였다. 효소반응은 전체부피를 100 μL로 하고 10 mM pNPG, 100 mM sodium phosphate (pH7.0), 그리고 적당량(주로 10-25 μg)의 효소를 참가한 후, 35oC에서 5-10 분간 수행하였다. 300 μL 1 M Na2CO3를 첨가해 vortexing하는 방법으로 반응을 종결시킨 후, 흡광광도계 (microplate reader, Tecan, Infinite M200)로 405 nm 파장에서 정량하였다. 비활성 (specific activity) 1 unit (U)은 35oC에서 분당 1 μmole의 pNPG를 가수분해하는데 필요한 효소양으로 결정하였다. 발현시스템에 의한 상대적인 가용성 발현양 평가를 위한 비활성은 전체단백질에서 β-glucosidase가 차지하는 비율을 고려하였다. 이를 위한 SDS/PAGE 상의 단백질 band 정량은 densitometer를 이용하였고, 상등액내의 단백질 정량은 Bradford protein assay법을 활용하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 항시발현 벡터의 발현특성 평가

본 연구진은 프로모터 트랩시스템을 활용하여 메타지놈 유래의 다양한 발현조절 서열을 발굴해 관련된 DNA 단편들의 유전정보를 기보고한 바 있다 [14]. 이중 다른 클론에 비해 상대적으로 높은 발현양을 보인 클론 (프로모터가 트랩되어 리포터인 GFPuv가 과발현)에서 메타지놈 유래의 G196 서열 (GenBank accession no. EU122304)을 발굴하였다. 해당 염기서열을 프로모터 예측 프로그램 (NNPP)으로 분석한 결과, 특정 유전자의 앞부위에 같은 방향으로 4개의 프로모터가 연속으로 배열된 특이한 서열을 발견하였다. 흥미로운 배열을 지닌 이러한 서열 (CEM 프로모터)은 각각 시그마인자 (sigma factor) 70, 70, 24, 그리고 38에 의해 인식이 가능하다(http://www.ccg.unam.mx/Computational_Genomics/PromoterTools/). 분석된 결과에 의하면, 이러한 배열은 다양한 생리조건에서 일정 수준이상의 발현이 필요한 housekeeping 단백질의 발현에 필요한 프로모터로 추정되어 진다 [16]. 즉, 변화된 환경에 따라 발현율이 달라지는 특정 유전자의 발현조절을 위한 배열이 아니라, 다양한 조건에서 발현이 담보되는 항시발현의 특성을 지닐 것이라고 예측할 수 있다. 선행 연구에서는 이러한 특성이 비파괴적으로 단백질의 과발현을 유도하며, 균질한 (homognous) 발현특성을 보여줌을 보고하였다 [15]. 본 연구에서는 유도체가 필요없는 조건에서, 기존의 유도시스템과는 다르게 균질한 발현품질을 보이는 이러한 특성 (non-invasive low level constitutive expession)이, 난발현 유전자의 가용성 발현증진도 유도할 수 있다는 가정하에 기본적인 발현특성 평가를 진행하였다.

우선, GFPuv가 클로닝된 pCEMT 벡터를 이용하여 발현특성을 분석하였다. 알려진 바와 같이, GPFuv도 유도발현 (explosive induction)조건에선 전체단백질의 20~30% (경우에 따라서는 그 이상)가 불용성 분획에서 발견되는 것으로 알려져 있다. Fig. 2(A)에서와 같이, 본 연구진이 제작한 항시발현 벡터는 유도체가 없는 조건에서 발현된 단백질이 대부분이 가용성으로 발현되며, 발현양은 시간에 따라 점진적으로 증가하는 것으로 관찰되었다. 또한 모태가 된 pG196 벡터에 비해 적어도 2.5~3배 이상 발현양이 증가된 것으로 분석되어 충분한 발현양도 담보할 수 있게 제작되었음을 알 수 있었다. 이러나 특성은 SDS-PAGE 분석에서는 물론 형광현미경을 통한 미생물 관찰과 형광분류기 (FACS)를 이용한 형광능 비교에서도 동일하게 관찰되었다 [15].


Fig. 2. 
SDS-PAGE analyses of expressed proteins under the control of the constitutive CEM and the inducible promoter trc. (A) Comparison of the expression level and solubility of GFPuv under the control of CEM promoter and the original G196 fragment in E. coli XL1-Blue. T, total protein; S, soluble fraction. (B) Comparison of the expression level and solubility of β-glucosidases under the control of CEM and trc promoter in E. coli XL1-Blue. T, total protein; S, soluble fraction; I, insoluble fraction.

3.2. 항시발현 CEM과 유도발현 Trc 프로모터의 β-glucosidase 발현양상 비교

GFPuv를 이용한 간접비교 결과를 기반으로, 대부분 불용성 응집체로 발현되는 β-glucosidase의 항시발현 벡터에서의 가용성발현 유도여부를 확인하기 위한 클로닝을 진행하였다. 이때, 대조군으로 100 copy 이상이 생성되는 pCEMT 이외에 상대적으로 낮은 copy 수를 지닌 pRCEMT (15-20 copy) 와 유도발현 시스템인 pTrc99a 벡터를 이용하였다. 제작된 재조합벡터는 서열분석을 통해 정확히 클로닝되었음을 확인한 후, 재료 및 방법에서 기술한 과정으로 발현특성 평가를 위한 SDS-PAGE와 광학농도계 (densitometer) 분석을 수행하였다. 결과는 Fig. 2B에 도시하고 Table 1에 기술하였다. 결과적으로, 유도발현 벡터 pTrc99a에서는 β-glucosidase가 전체 단백질의 17~18% 정도로 과발현되었으나, 65% 이상이 불용성 응집체를 형성함이 관찰되었다. 이러한 결과는 기존 연구결과와도 일치한다 [11,13]. 항시발현 벡터 pCEMT와 pRCEMT에서 발현된 β-glucosidase는 상대적으로 적은 발현양 (8시간 배양 시 전체 단백질의 10~13%)에도 불구하고 발현양의 82~90% 이상이 가용성으로 발현되었다. 예상대로 copy 수에 따른 발현양의 차이는 뚜렷하였으나, 가용성발현 비율은 유지되는 것으로 확인되었다. 단순한 분획과정을 통하여 가용성으로 확인된 단백질이 실제 상응하는 활성을 지닌 기능성 단백질임을 확인하고자, pNPG를 기질로 이용해 효소활성을 측정하였다. 가용성 분획비율과 유사하게, pCEMT와 pRCEMT에서 가용성으로 발현된 β-glucosidase는 각각 4.94 ± 0.15, 4.04 ± 0.27 U/mg protein의 활성을 보였다. 이는 유도발현 벡터인 pTrc99a에서 가용성으로 발현된 3.10 ± 0.22 U/mg protein의 활성보다 상대적으로 높은 결과값을 보여주었다. 경우에 따라, 불용성 응집체로 추정되는 분획에서도 활성이 나타나는 예가 있어 확인해 본 결과, 불용성 분획의 β-glucosidase는 활성을 지니지 않은 것으로 측정되었다. 이러한 가용성 발현율과 이에 따른 비활성은 단순한 유도조건의 변화 (발현 유도시간이나 유도제 농도, 그리고 배양온도)를 통해서도 쉽게 개선되지 않았다. 모든 실험에 사용된 가용성 분획의 총 단백질 양은 대략 0.19 ± 0.03 mg/mL이었다.

Table 1. 
Comparison of solubilization ratio and specific activity of the expressed β-glucosidase in E. coli XL1-blue
Plasmid β-glucosidase a Production Yielda
(% of total proteins)
Specific activityb
(U/mg)
Soluble (%) Insoluble (%)
pCEMT 82.0 18.0 13.5 4.94 ± 0.15
pRCEMT 90.5 9.5 10.8 4.04 ± 0.27
pTrc99a 34.2 65.8 17.6 3.10 ± 0.22
aAll values were measured in triplicate and the average values were represented.
bAll values were measured in triplicate and the average values with standard deviations were represented.

3.3. BL21(DE3) 기반 항시발현 CEM과 유도발현 T7 프로모터의 발현양상 비교

대장균 trplacUV5 프로모터 기반의 hybrid 프로모터인 trc 프로모터 이외에, bacteriophage T7에서 유래된 프로모터가 대장균에서 외래단백질 과발현에 흔히 이용되는 유도 프로모터이다. 이때, 숙주는 같은 바이러스에서 유래된 T7 RNA polymerase를 지녀야 하기에, 이런 목적에 맞게 제작된 균주가 BL21(DE3)와 JM109(DE3)이다. 따라서 이들 유도발현 시스템을 지닌 pET 벡터를 본 연구의 항시발현 벡터와 비교하는 실험을 진행하였다. 비슷한 원리를 지닌 유도발현 시스템의 경우에도 숙주나 벡터에 따라 발현품질이나 특성이 다를 수 있기 때문이다.

발현비교를 위한 숙주로는 E. coli BL21(DE3)를 선정하였고, 벡터는 pET21d(+)를 선정해 β-glucosidase를 클로닝하였다. 제작된 재조합 벡터와 비교군 (β-glucosidase가 클로닝된 pCEMT와 pRCEMT)을 숙주인 BL21(DE3)에 형질전환 한 후, 같은 조건에서 발현능을 비교하였다. Fig. 3에서와 같이 T7 프로모터의 조절을 통해 BL21(DE3)에서 발현된 β-glucosidase는 0.2 mM IPTG로 90분간 발현을 유도했을 때, 전체 단백질의 35% 정도로 과발현되었다. 이는 같은 유도발현 시스템인 trc 프로모터에 비해 대략 ~2배 정도의 발현양이 증가된 결과이다. 그러나, 짧은 시간에 과도한 양이 발현되는 폭발적생산 (explosive production)의 특성으로 인해 T7 프로모터에 의한 β-glucosidase의 생산은 심각한 성장저해 (growth retardation) 현상을 유발하였다. 또한, 가용성 분획의 β-glucosidase의 비율은 trc 프로모터로 조절되는 경우에 비해 2배정도 감소하는 것으로 관찰되었다. 결국 증가된 발현양 대비 가용성 단백질 비율은 오히려 trc 프로모터가 상대적으로 높은 것으로 확인되었다. 이와는 다르게 숙주가 달라졌음에도 pCEMT와 pRCEMT에서 발현되는 β-glucosidase 는 8 시간 배양을 통해 전체 단백질의 9 내지 5% 정도로 각각 발현되며, 발현된 단백질의 95% 이상이 가용성 분획에서 확인되었다 (Fig. 3Table 2). 이 경우 성장저해는 나타나지 않았고, 오히려 XL1-Blue 숙주에서보다 빠른 성장이 관찰되었다. 활성측정 결과에서도, 발현된 총단백질의 양은 T7 프로모터를 지닌 벡터에 비해 크게 적었지만, 활성은 유사하거나 경우에 따라 더 높게 나타나는 결과가 재현성있게 관찰되었다. 이러한 특성은 불용성으로 발현되는 단백질의 가용성 유도에 흔히 이용되는 단백질 접힘 보조인자, 즉 샤페론을 동시 발현시킨 경우에서도 크게 개선되지 않았다 (Fig. 3 그림의 오른쪽 패널참조). 그림과 같이, GroES와 GroEL, 그리고 DnaK, DnaJ, GrpE가 동시발현되는 pGro7과 pKJE7을 β-glucosidase가 발현되는 pET를 지닌 숙주에 도입하여 동시발현을 유도한 경우에도 발현양, 특히 가용성 발현양이나 비율은 크게 개선되지 않아, 항시발현의 경우가 좀 더 가용성 발현에 유리한 것으로 분석되었다. 상기 모든 실험에 사용된 가용성 분획의 총 단백질 양은 대략 0.39 ± 0.01 mg/mL이었다.


Fig. 3. 
Analyses of expression level and solubility of β-glucosidases under the control of CEM and T7 promoter in E. coli BL21(DE3). C1, total protein of cells harboring pCEMT; C2, total protein of cells harboring pET21d(+); T, total protein; S, soluble fraction; I, insoluble fraction.

Table 2. 
Comparison of solubilization ratio and specific activity of the expressed β-glucosidase in E. coli BL21(DE3)
Plasmid β-glucosidase a Production Yielda
(% of total proteins)
Specific activityb
(U/mg)
Soluble (%) Insoluble (%)
pCEMT 95.1 4.9 9.6 2.56 ± 0.12
pRCEMT 97.2 2.8 5.5 1.37 ± 0.11
pET21 17.6 82.4 35.8 2.06 ± 0.20
aAll values were measured in triplicate and the average values were represented.
bAll values were measured in triplicate and the average values with standard deviations were represented.

3.4. DISCUSSION

친환경적이고 지속가능한 생물공정에 대한 중요성으로 인해, 천연기질에 대한 높은 활성을 지닌 새로운 생촉매, 즉 효소는 지속적인 선별대상이 되고 있다. S. meliloti 유래의 β-glucosidase는 이러한 요구에 잘 부합되는 효소 중 하나로서, 다양한 천연기질에 대한 높은 활성으로 인해 식품, 염색, 화장품, 그리고 의약분야까지 폭 넓은 활용성을 지니고 있다 [1,2]. 이러한 다기능적 특성은 상기 효소의 리포터로서의 활용까지도 가능하게 한다 [17]. 하지만, 산업적 실응용을 위한 과발현을 유도할 경우, 대부분의 단백질이 불용성 응집체로 발현되는 특성을 보여주는 근본적인 문제점을 지니고 있다.

대장균에서 쉽게 불용성 응집체를 형성하는 외래 단백질의 가용성 발현증진을 위한 많은 노력들이 진행되고 있다 [12]. 이러한 전략은 최적의 벡터와 숙주를 선별하는 단계로부터 시작한다. 또한 MBP와 같은 가용성 증진을 위한 융합 파트너의 채용이나 배양온도와 같은 조건을 최적화하는 과정도 빈번하게 이용되는 전략이다. 하지만 융합파트너를 채용하는 전략은, 의약단백질과 같이 선택적으로 이를 제거하는 부수적인 과정과 추가 정제공정을 필요로 하는 단점이 있다. 또한 배양이나 단백질 발현 유도조건 변화를 통한 가용성 유도는 생산양에 따른 실효성은 물론, 조건확립에 많은 시간과 노동력을 필요로 하는 단점이 있다.

이러한 전략이외에, GroEL/ES 혹은 DnaK/DnaJ/GrpE와 같은 단백질 접힘 보조인자, 즉 샤페론을 채용하는 전략도 흔히 이용된다. 최근에 Agrobacterium tumefaciens C58 유래의 β-glucosidase의 가용성을 증진시키기 위해 GroEL/ES나 Lo18과 같은 작은 크기를 지닌 샤페론을 동시발현시킨 보고가 있다 [18]. 이러한 결과에 기반해, 본 연구에서도 araB 프로모터에 의해 발현이 유도되는 DnaK/DnaJ/GrpE 혹은 GroES/EL 샤페론을 T7 프로모터로 β-glucosidase의 발현을 조절하는 발현벡터를 지닌 BL21(DE3)에 도입하였다. 결과적으로, 두 경우 모두에서 주목할 만한 가용성 증진효과는 얻을 수 없었다. 단지, GroES/EL 샤페론을 동시발현시킨 경우에만 대략 15% 정도의 가용성 발현이 늘어나는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 이러한 개선정도는 비활성 측정결과, 단순히 항시발현 벡터를 이용해 XL1-Blue에서 발현을 유도한 pCEMT-β-glucosidase와 유사하거나 극히 작은 증가만이 관찰되었다. 이러한 활성값도 급진적 발현유도의 결과로 나타나는 성장저해와 값비싼 유도체 비용을 고려하면 실효성이 없는 결과이다. 따라서 S. meliloti 유래 β-glucosidase의 경우, 기존의 전형적인 유도발현 벡터를 이용하거나 샤페론을 동시에 발현시키는 과정으로는 가용성발현 증진이 어렵다는 결과를 얻었다.

본 연구의 가용성 발현증진에 사용한 항시발현 시스템은 목적하는 단백질을 발현시키는 과정에 값비싼 유도체를 사용하지 않아도 되고, 온도를 낮추는 등의 최적 발현조건 탐색에 드는 비용과 시간을 절약하는 장점을 지니고 있다. 또한 성장저해와 같은 부작용도 없는 것으로 확인되었다. 단점으로 제시될 수 있는 발현시기의 조절 불가능의 문제도, 치료용이나 이미징 목적으로 관련단백질을 동물 (인간 포함)이나 식물내에서 발현시키는 경우 유도체를 주입할 필요가 없기 때문에 오히려 장점으로 부각될 수 있다 [19]. 외래 유전자의 동식물 내 발현 (in-situ expression in animal body) 유도과정에서 빛 (적외선)과 같은 비파괴적인 방법이 없으면 매우 어렵기 때문이다. 또한 유도발현 시스템의 전형적인 예에서처럼 T7 RNA polymerase 유전자가 도입된 숙주의 필요, 샤페론의 동시발현을 위해 도입되는 벡터의 기존 벡터와의 양립성 (compatibility) 등도 고려할 필요가 없는 장점을 보여준다 [20,21]. 보고된 결과에 의하면, 막단백질과 같은 난발현 단백질의 경우에도 유도시스템보다는 항시발현 시스템이 유리하다는 결과도 존재한다 [22]. 따라서 본 연구에서 사용한 항시발현 시스템은 난발현 유전자의 가용성 발현 증진에 기존방법을 대체하거나 보완하는 시스템으로 활용이 가능할 것으로 기대된다.


4. CONCLUSION

S. meliloti 유래 β-glucosidase는 전형적인 유도발현 프로모터인 trc와 T7를 이용해 IPTG로 발현을 유도하면, 대장균 XL1-blue와 BL21(DE3)에서 주로 불용성 응집체로 발현되었다. 반면에 메타지놈에서 유래된 항시발현 CEM 프로모터를 이용하면 가용성 비율이 크게 증가하는 것으로 조사되었다. 비록 전체단백질 양에서는 유도발현 벡터에 비해 상대적으로 적지만 가용성 발현비율의 증가에 의한 비활성은 더 높게 측정되었다. 이는 기존 유도발현 벡터와는 다른 발현특성을 보여주는 결과임으로, 난발현 유전자의 가용성 발현유도에 새로운 도구를 제공할 수 있을 것이다.


Acknowledgments

본 연구는 2021년 과학기술정보통신부 기초연구 지원사업 (2021R1A2C1006734)과 해양수산부 해양수산생명공학기술개발사업 (20170305)의 지원에 의해 이루어졌으며, 이에 감사드립니다.


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